IMVIC = Indol-Metil
red - Voges proskauer -Citrat
a. Uji Methyl
Red
Pada
kaldu gula yang berisi tabung Durham,
dapat diketahui kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat,
tetapi hasil produksi fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan
media MR-VP untuk mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi
butanadiol.
Uji methyl red digunakan untuk
menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan
glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan
menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan
indikator pH ”methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam.
Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning
dalam lingkungan dengan pH 6.2.
Fermentasi asam campuran ditentukan
dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan
setelah masa inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. Bila
terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah. Bila
tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning
setelah penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam
identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.
Bahan
yang diperlukan:
Biakan
:Escherichia coli.
Enterobacter aerogenes
Kaldu
MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer)
Reagens
Methyl Red
Cara
mengerjakan :
Hari
Pertama
1.
Tandai
tabung kaldu MR-VP dengan: biakan bakteri yang digunakan.
2.
Inokulasi
kaldu MR-VP dengan biakan bakteri.
3.
Inkubasikan
dalam 350C selama 5 x 24 jam.
Hari
Kedua
1.
Tambahkan
5 tetes reagens methyl red kedalam tabung MR-VP.
2.
Laporkan
hasilnya.
Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan
reagens methyl red.
Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah menjadi kuning atau
jingga setelah penambahan reagens.
Organisme
|
Perubahan
warna setelah penambahan reagens
|
E.
coli
|
|
E.
aerogenes
|
|
b.
Uji Voges-Proskauer
Uji ini digunakan untuk
mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanadiol.
Bila bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk
utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alphanaphtol dalam ethanol
dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbonil), suatu senyawa pemuka
dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukan
adanya perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas
dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih
jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol
dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian
dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja.
Uji Voges-Proskauer sebenarnya
merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3-butanadiol dan selalu
didapatkan secara serentak, sehingga uji VP absah untuk menentukan adanya
2,3-butanadiol.
Bahan
yang diperlukan:
Biakan
: Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
Kaldu
MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer)
Larutan
40% KOH
Larutan
5% alpha-naphtol
Cara
mengerjakan :
Hari
Pertama
1.
Tandai
kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan.
2.
Inokulasi
kaldu MR-VP dengan biakan bakteri.
3.
Inkubasikan
dalam 350C selama 24 – 48 jam.
Hari
Kedua
1.
Tambahkan
10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alpha-naphtol dalam kaldu MR-VP.
Kocok tabung sehingga kaldu terlihat berbuih. Pengocokan dengan
baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi 2,3-butanadiol
menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil reaksi dapat
terlihat paling lambat setelah 30 menit.
2.
Laporkan
hasilnya.
Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit
setelah penambahan reagens.
Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP tidak memperlihatkan
perubahan warna setelah penambahan reagens.
Organisme
|
Perubahan
warna setelah penambahan reagens
|
E.
coli
|
|
E.
aerogenes
|
|
c. UJI INDOL
Asam amino triptofan merupakan
kompunen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini
dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.
Bakteri tertentu seperti misalnya Escherichia Coli mampu menggunakan triptofan
sebagai sumber karbon.
E. coli menghasilkan enzim
triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari triptofan.
Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian
lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH4
+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme.
Reagens
bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan
berwarna merah pada permukaan medium.
Untuk uji ini digunakan media semi
padat yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan
beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme. Semua reagens
tersebut mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Dalam praktikum digunakan
reagens Ehrlich-Bohme yang terdiri reagens A dan reagens B.
Media untuk melihat pembentukan
indol yang digunakan di laboratorium bersifat semi-padat, oleh karena itu dapat
digunakan juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan
terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media. Media
indol diinokulasikan dengan menusukkan jarum kedalam media semi-padat.
Bahan
yang diperlukan :
Biakan
: Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
Proteus vulgaris
Biakan semi-padat yang kaya triptofan.
Reagens
untuk melihat pembentukan indol.
Cara
mengerjakan :
Hari
Pertama
1.
Tandai
tabung dengan nama, tanggal, dan mikroorganisme yang digunakan.
2.
Inokulasi
biakan semi-padat dengan cara menusukan jarum sampai pada kedalaman ¾ bagian
dari permukaan media.
3.
Inkubasikan
pada suhu 350C selama 24 – 48 jam.
Hari
Kedua
1.
Tambahkan
reagens Ehrlich-Bohme ke dalam biakan semi-padat. Penumpukan indol dalam media
ditandai oleh warna merah pada permukaan media beberapa menit setelah
penambahan reagens.
2.
Gambar
pertumbuhan mikroba pada media semisolid.
3.
Laporkan
hasil pengujian!
Mikroorganisme
|
Warna
lapisan permukaan setelah penambahan reagens
|
Uji
motilitas
|
E.
coli
|
|
|
E.
aerogenes
|
|
|
P.
vulgaris
|
|
|
Uji Ehrlich-Bohme
Cairan A :
para-dimetil-benzaldehida dalam alkohol 96%
Cairan B : cairan kalium persulfat jenuh (K2S2O3)
PEMBUATAN REAGEN ERLICH
Fungsinya : Untuk pemeriksaan urobilin urine.
Komposisi :
Paradimetil amino benzildehida 2 gram
HCl 38 % 50 ml
Aquadest 1000 ml
Cara Pembuatan :
Timbang paradimetil amino benzildehida 2 gram dengan menggunakan neraca
elektrik dan gelas arloji.
Masukkan ke dalam beaker glass.
Pipet HCl 38 %sebanyak 50 ml, masukkan ke dalam beaker glass tadi.
Add kan dengan aquadest sampai 1000 ml, homogenkan.
Masukkan ke dalam botol reagen dan beri etiket.
PEMBUATAN REAGEN KOVACS
1.
N- amyl alkohol 75
ml
2.
HCL pekat 25 ml
3.
Para dimetil amino benjaldehide (PDAB) 5 g
As amino TRIPTOFAN
-------------------------------› INDOL +
ASAM PYRUFAT
Enzim Triptofanase (E.Coli)
INDOL + P-dimetil amino benzaldehida -------------------------------› ROSINDOL
(REAGEN Ehrlich) (merah)
§ Tugas Cari rumus
molekul reaksi diatas ?
Buku Biokimia HERPER, Farmacofea Indonesia (FI IV),
Reagens
diteteskan ke atas biakan sebanyak 10-12 tetes, jika terdapat pembentukan indol
akan terlihat warna merah/merah muda pada bagian atas media biakan.
12.2
UJI IMVIC
Untuk membedakan Enterobacter
aerogenes dan Escherichia coli dilakukan uji IMVIC yang terdiri dari uji-uji :
Indol
– Methyl red – Voges Proskauer – Citrat
Kedua mikroorganisme tersebut akan
memberikan hasil sebagai berikut :
I M Vi
C
E.
coli + + - -
A.
aerogenes - - + +
D.
PENGGUNAAN SITRAT
Uji
Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat
digunakan medium sitrat – Koser berupa medium cair atau medium sitrat – Simmon
berupa medium padat. Simmon’s citrate agar merupakan medium sintetik dengan Na
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai
sumber N dan brom thymol blue
sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat-Koser tidak mengandung indikator.
Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari
medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium
dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan
bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satun
ya
sumber karbon. Sedangkan para medium sitrat-Koser kemampuan menggunakan sitrat
ditunjukan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.
Bahan
yang diperlukan:
Biakan
: Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
Proteus vulgaris
Media
biakan : Simmons citrate agar
Cara
mengerjakan :
Hari
Pertama :
1.
Tandai
tabung Simmon’s citrate agar dengan nama, tanggal, dan nama
mikroorganisme yang di uji.
2.
Inokulasi
tabung agar dengan inokulum yang tipis.
Inokulum yang tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan
akan dapat tumbuh dalam Simmon’s citrate agar, sehingga hasil pengujian dapat
memberikan hasil yang tidak benar.
3.
Inkubasi
pada suhu 350C selama 48 jam.
Hari
Kedua
1.
Perhatikan
perubahan warna dengan melihat pertumbuhan dan perubahan warnadari hijau ke
biru.
2.
Laporkan
hasil pengujian!
Mikroorganisme
|
Warna
setelah masa inkubasi
|
Kesimpulan
hasil pengujian
|
E.
coli
|
|
|
E.
aerogenes
|
|
|
P.
vulgaris
|
|
|
P.
aeruginosa
|
|
|