UJI IMVIC

IMVIC = Indol-Metil red - Voges proskauer -Citrat

a. Uji Methyl Red

            Pada kaldu gula  yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR-VP untuk mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butanadiol.

            Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH ”methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6.2.

            Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens methyl red ke dalam kaldu. Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.

Bahan yang diperlukan:

Biakan :Escherichia coli.

              Enterobacter aerogenes

Kaldu MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer)

Reagens Methyl Red

Cara mengerjakan :

Hari Pertama

1.      Tandai tabung kaldu MR-VP dengan: biakan bakteri yang digunakan.

2.      Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri.

3.      Inkubasikan dalam 35⁰C selama 5 x 24 jam.

Hari Kedua

1.      Tambahkan 5 tetes reagens methyl red kedalam tabung MR-VP.

2.      Laporkan hasilnya.

Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagens methyl red.

Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubah menjadi kuning atau jingga setelah penambahan reagens.

Organisme	Perubahan warna setelah penambahan reagens
E. coli
E. aerogenes

b. Uji Voges-Proskauer

            Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alphanaphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbonil), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukan adanya perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja.

            Uji Voges-Proskauer sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga uji VP absah untuk menentukan adanya 2,3-butanadiol.

Bahan yang diperlukan:

Biakan : Escherichia coli

              Enterobacter aerogenes

Kaldu MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer)

Larutan 40% KOH

Larutan 5% alpha-naphtol

Cara mengerjakan :

Hari Pertama

1.      Tandai kaldu MR-VP dengan biakan bakteri yang digunakan.

2.      Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bakteri.

3.      Inkubasikan dalam 35⁰C selama 24 – 48 jam.

Hari Kedua

1.      Tambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alpha-naphtol dalam kaldu MR-VP.

Kocok tabung sehingga kaldu terlihat berbuih. Pengocokan dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi 2,3-butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit.

2.      Laporkan hasilnya.

Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagens.

Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens.

                  

Organisme	Perubahan warna setelah penambahan reagens
E. coli
E. aerogenes

c.  UJI INDOL

            Asam amino triptofan merupakan kompunen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya Escherichia Coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon.

            E. coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH₄
⁺) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme.

Reagens bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium.

            Untuk uji ini digunakan media semi padat yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme. Semua reagens tersebut mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Dalam praktikum digunakan reagens Ehrlich-Bohme yang terdiri reagens A dan reagens B.

            Media untuk melihat pembentukan indol yang digunakan di laboratorium bersifat semi-padat, oleh karena itu dapat digunakan juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media. Media indol diinokulasikan dengan menusukkan jarum kedalam media semi-padat.

Bahan yang diperlukan :

Biakan : Escherichia coli

              Enterobacter aerogenes

              Proteus vulgaris

Biakan semi-padat yang kaya triptofan.

Reagens untuk melihat pembentukan indol.

Cara mengerjakan :

Hari Pertama

1.      Tandai tabung dengan nama, tanggal, dan mikroorganisme yang digunakan.

2.      Inokulasi biakan semi-padat dengan cara menusukan jarum sampai pada kedalaman ¾ bagian dari permukaan media.

3.      Inkubasikan pada suhu 35⁰C selama 24 – 48 jam.

Hari Kedua

1.      Tambahkan reagens Ehrlich-Bohme ke dalam biakan semi-padat. Penumpukan indol dalam media ditandai oleh warna merah pada permukaan media beberapa menit setelah penambahan reagens.

2.      Gambar pertumbuhan mikroba pada media semisolid.

3.      Laporkan hasil pengujian!

Mikroorganisme	Warna lapisan permukaan setelah penambahan reagens	Uji motilitas
E. coli
E. aerogenes
P. vulgaris

Uji Ehrlich-Bohme

Cairan A :  para-dimetil-benzaldehida dalam alkohol 96%

Cairan B : cairan kalium persulfat jenuh (K₂S₂O₃)

 PEMBUATAN REAGEN ERLICH

Fungsinya : Untuk pemeriksaan urobilin urine.
Komposisi :
Paradimetil amino benzildehida 2 gram
HCl 38 % 50 ml
Aquadest 1000 ml
Cara Pembuatan :
Timbang paradimetil amino benzildehida 2 gram dengan menggunakan neraca elektrik dan gelas arloji.
Masukkan ke dalam beaker glass.
Pipet HCl 38 %sebanyak 50 ml, masukkan ke dalam beaker glass tadi.
Add kan dengan aquadest sampai 1000 ml, homogenkan.
Masukkan ke dalam botol reagen dan beri etiket.
 

PEMBUATAN  REAGEN  KOVACS

1.      N- amyl alkohol                                              75 ml

2.      HCL pekat                                                      25 ml

3.      Para dimetil amino benjaldehide  (PDAB)          5 g

As amino TRIPTOFAN     -------------------------------›  INDOL      +     ASAM PYRUFAT

                                        Enzim Triptofanase (E.Coli)

INDOL   +  P-dimetil amino benzaldehida  -------------------------------›   ROSINDOL

                      (REAGEN Ehrlich)                                                                  (merah)

§ Tugas  Cari rumus molekul reaksi diatas ?

Buku Biokimia HERPER, Farmacofea Indonesia (FI  IV),

Reagens diteteskan ke atas biakan sebanyak 10-12 tetes, jika terdapat pembentukan indol akan terlihat warna merah/merah muda pada bagian atas media biakan.

12.2 UJI IMVIC

            Untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan Escherichia coli dilakukan uji IMVIC yang terdiri dari uji-uji :

Indol – Methyl red – Voges Proskauer – Citrat

            Kedua mikroorganisme tersebut akan memberikan hasil sebagai berikut :

                                                I           M         Vi        C

E. coli                                      +          +          -           -

A. aerogenes                           -           -           +          +

D. PENGGUNAAN SITRAT

            Uji  Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium sitrat – Koser berupa medium cair atau medium sitrat – Simmon berupa medium padat. Simmon’s citrate agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH₄⁺ sebagai sumber N dan brom thymol  blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat-Koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satun

ya sumber karbon. Sedangkan para medium sitrat-Koser kemampuan menggunakan sitrat ditunjukan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.

Bahan yang diperlukan:

Biakan : Escherichia coli

              Enterobacter aerogenes

              Proteus vulgaris

Media biakan : Simmons citrate agar

Cara mengerjakan :

Hari Pertama :

1.      Tandai tabung Simmon’s citrate agar dengan nama, tanggal, dan nama mikroorganisme yang di uji.

2.      Inokulasi tabung agar  dengan inokulum yang tipis.

Inokulum yang tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan akan dapat tumbuh dalam Simmon’s citrate agar, sehingga hasil pengujian dapat memberikan hasil yang tidak benar.

3.      Inkubasi pada suhu 35⁰C selama 48 jam.

Hari Kedua

1.      Perhatikan perubahan warna dengan melihat pertumbuhan dan perubahan warnadari hijau ke biru.

2.      Laporkan hasil pengujian!

Mikroorganisme	Warna setelah masa  inkubasi	Kesimpulan hasil pengujian
E. coli
E. aerogenes
P. vulgaris
P. aeruginosa

mikroskop dengan kamera

uji angka kapang khamir

Uji Angka Kapang Khamir

Ruang Lingkup

Metode ini digunakan untuk menetapkan angka kapang khamir dalam makanan dan minuman, obat tradisional dan sediaan kosmetika.

Prinsip

Pertumbuhan kapang/ khamir setelah cuplikan diinokukalisan pada media yang sesuai dan diinkubasi pada suhu 20 -25 ⁰ C.

Pereaksi khusus

Desinfektan alcohol 70%

Media dan pengencer

Potato Dextrose Agar (PDA) ***catatan : cara pembuatan lihat Farmecofea Indonesia hal 846

Kentang. ¼ kg

Sukrosa ¼ kg

Agar swallow 1 bks

Indikator universal

Asam tatrat / asam citrate 10 % steril

Kertas saring.

Air suling Agar 0,05% (ASA) steril

Pereaksi

Kloramfenicol 100 mg/l media.

Sampel : susu kental manis : AKK : maks 2. 10²koloni / g

Buah kering, ; AKK maks 5. 10¹ koloni/g

Jeli agar ; AKK maks ; 1.10² koloni/ g

Serealia ; AKK Maks ; 1.10⁴ koloni/g

Alat-alat

LAF (laminar air Flow)

Stomaker atau blender

Pipet ukur mulut lebar 10 ml

Pipet ukur 1 ml

Tabung reaksi tinggi 14 cm diameter 1 cm

Cawan petri diameter 10 cm

Lampu spiritus

Cara kerja

1. Pembuatan media PDA **(lihat farmacofe Indonesia IV. Hal 846)

2. Homogenisasi sampel

3. Untuk masing-masing sampel disiapkan 3 buah tabung reaksi yang masing –masing telah diisi 9 ml ASA.

4. Dari hasil homogenisasi pada penyiapan contoh yang merupakan pengenceran 10^-1 dipipet 1 ml kedalam tabung ASA pertama sehingga diperileh pengenceran 10^-2. Dibuat pengenceran berikutnya sehingga diperoleh pengenceran sesui batas maksimum persyaratan masing-masing sampel.

5. Siapkan Cawan petri steril yang telah diisi PDA kurang lebih 12 ml atau secukupnya sampai memenuhi permukaan cawan secara aseptis . Biarkan memadat.

6. Tuangkan 0,5 ml sampel pada permukaan PDA, segera goyangkan dipermukaan meja pola angka 8 sehingga suspensi tersebar merata dan dibuat duplo. Lakukan hal yang sama pada sampel pengenceran berikutnya.

7. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dilakukan uji blanko.

- Kedalam satu cawan petri di tuangkan PDA dan dibiarkan memadat

- Kedalam cawan petri yang lain dituangkan PDA dan pengencer 1 ml kemudian dibiarkan memadat.

8. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20 – 25⁰ C dan diamati pada hari ke -3 sampai hari ke -5 . Koloni khamir (ragi) memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai bakteri.

9. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

mikrobiologi air

Analisis Mikroba Dalam Air

berbagai mikroba patogen sering kali di tularkan melaui air yang tercemar sehingga dapat menimbulkan penyakit pada manusia maupun hewan. mikroba ini biasanya terdapat dalam saluran pencernaan dan mencemari air melalui tinja. mikroba asal tinja yang sering menyebabkan penyakit yang ditularkan melalui air (water-bornedisease) mencakup salmonell typhi, shigella spp., salmonella paratyphi dan vibrio cholerae. disentri yang disebabkan oleh campylobacter dan escherichia coli dapat pila ditularkan melalui air. bakteri, virus dan protozoa dapat juga mencemari air melalui tinja. sehingga menyebabkan penyakit. virus yang dapat mencemari air melalui tinja adalah hepatitis A dan polio.
keragaman mikroba yang dapat menimbulkan berbagai penyakit ini menyebabkan para ahli mencari indikator untuk menunjukan adanya mikroba patogen sehingga dapat diketahui kualitas mikrobiologi air atau sanitasi air. sebagai indikator banyak digunakan kelompok kolifrom, meskipun dapat digunakan indikator lain. analisis mikrobiologi yang lengkap ditulis dalam "standard methods for the examination of water and wastewater" (american public health association., 15th ed.).

Analisis kolifrom dengan mpn
dalam methode MPN (most probable number) untuk uji kualitas mikribiologi air dalam praktikum digunakan kolifrom sebagai indikator. kelompok kolifrom mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaerobik fakukatif, barang gramnrgatif dan tidak membentuk spora. kolifrom memfrementasikan laktora dengan asam dan gasdalam waktu 48 jam pada suhu 35 derajat celcius. kelompok kolifrom dipilahkan menjadi kokifrom asal tinja dan bukan-tinja (misalnya tanah). kolifrom asal tinja mampu menghasilkan gasdalam kaldu E.C dalam waktu 24 jam pada suhu 44.5 derajat celcuis.